Fluorescein-5-maleimide熒光定量PCR技術(shù)，即是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。具有應(yīng)用范圍廣，靈敏度高，操作簡(jiǎn)便、特異性和可靠性更強(qiáng)、自動(dòng)化程度高、無(wú)污染、具實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)。              

RNA提取（Trizol法）

Trizol試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，Fluorescein-5-maleimide劑并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯仿時(shí)，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開(kāi)。水相層（無(wú)色）主要為RNA，有機(jī)層（黃色）主要為DNA和蛋白質(zhì)。

Fluorescein-5-maleimide實(shí)驗(yàn)步驟：

1.  RNA的提取；

2.  反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；

3.  PCR擴(kuò)增；

4.  產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測(cè)定。

 Fluorescein-5-maleimide送樣要求：

1、組織樣本：-20℃或-80℃低溫冰箱中保存，液氮或者干冰運(yùn)輸;市內(nèi)或短途運(yùn)輸可冰袋運(yùn)輸。若提供的材料為新鮮組織、血液細(xì)胞等生物材料，請(qǐng)?zhí)峁┳銐蛱崛?/span>2ug以上基因DNA的材料量。

2、DNA樣本：體積≥50ul，濃度≥50ng/ul，DNA總量≥2ug，純度 OD260/280 在1.7～1.9之間，不含PCR抑制劑，須注明準(zhǔn)確濃度。樣品須低溫冰袋運(yùn)輸。

3、血液樣本：要求保存于抗凝管中或凍存管中，體積大于2ml，請(qǐng)用干冰運(yùn)送，保證DNA不降解。

4、樣品為石蠟包埋組織切片的，Fluorescein-5-maleimide要求提供10張組織切片光片(面積>10mm×10mm,厚度約5-10um)。