與其他結(jié)構(gòu)生物學(xué)家一樣，Eva Nogales趕上了好時(shí)機(jī)。這位美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校的教員現(xiàn)在可以利用新工具，解決幾年前根本無法解答的細(xì)胞分子機(jī)制問題。

 

*近，Nogales和同事、分子生物學(xué)家、CRISPR-Cas9的聯(lián)合發(fā)明人Jennifer Doudna的合作項(xiàng)目正是個(gè)好例子。她們都對(duì)R環(huán)十分感興趣。很多情況下，在DNA被CRISPR-Cas9剪切前，細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成一個(gè)由核苷酸構(gòu)成的R環(huán)。Nogales等人對(duì)化膿性鏈球菌中的R環(huán)進(jìn)行了成像，得到了近原子分辨率的結(jié)構(gòu)圖像，提示了Cas9酶在特定位點(diǎn)如何打開DNA，并使其可用于CRISPR的分子剪刀。

 

這項(xiàng)工作*突出的是科學(xué)家能快速地將功能與結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來，而且他們能把成像方法結(jié)合起來。一個(gè)多世紀(jì)以來，結(jié)構(gòu)生物學(xué)的優(yōu)選方法一直是X射線晶體衍射法。但有些生物分子太大或太小，難以結(jié)晶，因此不能采用X射線法。而且，一些分子在發(fā)揮功能時(shí)，會(huì)發(fā)生形態(tài)或朝向的變化，而結(jié)晶法無法捕捉這些變化。

 

現(xiàn)在，科學(xué)家擁有一個(gè)龐大的成像工具庫(kù)。低溫電子顯微鏡或化學(xué)家的核磁共振（NMR）成像等方法，都能在不結(jié)晶的情況下，獲得接近原子分辨率的結(jié)構(gòu)圖像，從而揭示分子的形狀、大小和方向。但并非所有方法對(duì)活細(xì)胞內(nèi)的全部蛋白質(zhì)、核酸都有用。

 

經(jīng)驗(yàn)證明，沒有一個(gè)單一的方法足以探討細(xì)胞中發(fā)生的動(dòng)態(tài)行為和復(fù)雜的相互作用。*好的解決辦法是整合來自多個(gè)工具的圖像。

 

這種方法得到了諸多追隨者。斯坦福大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)家Roger Kornberg指出，每個(gè)方法都能提供一些重要信息，結(jié)合起來，就能實(shí)現(xiàn)1+1>2的效果。由于在揭示基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制方面的貢獻(xiàn)，Kornberg于2006獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。對(duì)于這一突破性研究，他使用的是X射線晶體衍射法?，F(xiàn)在，和其他晶體學(xué)家一樣，他開始使用多種方法的結(jié)合。

 

Kornberg繼續(xù)分析RNA聚合酶II，但現(xiàn)在他把冷凍電鏡和晶體學(xué)技術(shù)結(jié)合起來。與晶體技術(shù)相比，冷凍電鏡可用于不易結(jié)晶的生物分子，并且能解析較大的分子，但目前分辨率則稍遜一籌。Kornberg實(shí)驗(yàn)室還使用化學(xué)交聯(lián)和質(zhì)譜法，揭示鄰近蛋白質(zhì)之間的關(guān)系以及利用已知蛋白質(zhì)信息進(jìn)行同源性建模。

 

同時(shí)，Nogales和Doudna團(tuán)隊(duì)也使用混合方法研究R環(huán)。Nogales表示，“高分辨率的X射線晶體法無法解析完整的R環(huán)結(jié)構(gòu)。”所以他們用冷凍電鏡在低分辨率上對(duì)完整的環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。只有把兩者結(jié)合起來，研究人員才能真正揭示CRISPR-Cas9中R環(huán)的作用。

 

這種混合或綜合性方法有助于研究人員深入研究基礎(chǔ)科學(xué)問題，對(duì)**開發(fā)人也非常有用。細(xì)胞膜上的大蛋白質(zhì)往往是**靶標(biāo)，高分辨率混合方法能揭示**與受體相互作用的原子細(xì)節(jié)。同樣，通過展示艾滋病病毒、埃博拉病毒和其他病原體的包膜蛋白與**細(xì)胞相互作用機(jī)制，能有助于疫苗發(fā)展。納什維爾范德堡大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)家Jens Meiler表示，這些結(jié)構(gòu)對(duì)人們理解**系統(tǒng)的工作機(jī)制非常重要。

 

Noglaes總結(jié)到：“這是混合方法的黃金時(shí)代?！?

 

夢(mèng)想成真

 

德國(guó)歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBL)細(xì)胞生物和生物物理部主任Jan Ellenberg表示，這個(gè)時(shí)代對(duì)很多生命科學(xué)家來說，是夢(mèng)想成真的時(shí)代。這個(gè)夢(mèng)想是從原子層面無縫銜接到細(xì)胞層面。針對(duì)細(xì)胞大分子的深入理解自然能解答結(jié)構(gòu)生物學(xué)的首要問題：一個(gè)分子的結(jié)構(gòu)是怎么和其功能聯(lián)系在一起的?

 

結(jié)構(gòu)生物學(xué)家工具箱中的每種技術(shù)都提供了不同的視角。生物學(xué)家相信，使用混合方法構(gòu)建的模型可以準(zhǔn)確地反映分子或復(fù)合體在細(xì)胞中的行為。Meiler說：“你需要把這些技術(shù)結(jié)合起來，才能得到**答案?！?

 

X射線晶體衍射一直是確定蛋白質(zhì)原子結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)方法。在成立于1971年的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)銀行擁有的大約12萬個(gè)模型中，約有90%來自晶體學(xué)研究。

 

不過，對(duì)于結(jié)構(gòu)生物學(xué)家而言，該技術(shù)雖然分辨率高，但也有局限性。首先，樣品要高度純化，以產(chǎn)生有序的晶體?？茖W(xué)家通過分析原子如何散射光確定分子結(jié)構(gòu)。該技術(shù)需要有足夠的原子，以產(chǎn)生可測(cè)量的衍射圖案，并且每一個(gè)晶體必須是靜態(tài)的。因此，該方法不能揭示一個(gè)分子是如何運(yùn)動(dòng)的以及如何起作用的，也不能揭示它如何與其他系統(tǒng)互動(dòng)。

 

德國(guó)復(fù)雜系統(tǒng)研究所計(jì)算結(jié)構(gòu)生物學(xué)小組組長(zhǎng)Gunnar Schroder指出，蛋白質(zhì)不僅僅是一個(gè)單一的靜態(tài)結(jié)構(gòu)，“通常情況下，你想看到的是整個(gè)蛋白質(zhì)如何工作”。Schroder使用混合方法理解蛋白的行為和彼此間的聯(lián)系。晶體技術(shù)能提供蛋白在脫離正常環(huán)境時(shí)的快照。但結(jié)構(gòu)生物學(xué)家需要其他方法補(bǔ)充晶體結(jié)構(gòu)信息，并提高他們對(duì)蛋白質(zhì)形態(tài)和功能的理解。

 

此外，許多蛋白質(zhì)，例如細(xì)胞膜上的**靶點(diǎn)，是靈活而不穩(wěn)定的。為了讓這些蛋白質(zhì)形成晶體，研究人員經(jīng)常要在某種程度上改變它們。Meiler指出，改變樣本可能無法準(zhǔn)確反映分子的原生態(tài)以及其在細(xì)胞內(nèi)的排布方式。他把實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法結(jié)合，以便更好地理解分子結(jié)構(gòu)。“晶體法是很好的初始方法，但這個(gè)方法不足以提供功能方面的信息?！彼f。

 

幫個(gè)小忙

 

Nogales等人使用的混合策略達(dá)到了10埃的整體分辨率，相比于以往分析的30埃分辨率是極大的進(jìn)步。分辨率的提高帶來了新視角，正如Nogales所說，“我們可以看到氨基酸與DNA的相互作用”。

 

但冷凍電鏡要求標(biāo)本被冰凍。這并不理想，因?yàn)槔鋬龅臉颖具h(yuǎn)遠(yuǎn)脫離了自身動(dòng)態(tài)、天然的狀態(tài)。而核磁共振光譜可以解決這個(gè)問題。Schroder表示，“核磁共振有一個(gè)很大的優(yōu)勢(shì)，你可以在室溫下觀察樣本，蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)信息?！彼膶?shí)驗(yàn)室通過整合NMR、冷凍電鏡和晶體學(xué)數(shù)據(jù)，建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?

 

NMR于20世紀(jì)40年代被**應(yīng)用到實(shí)驗(yàn)中。研究人員在外部磁場(chǎng)中激發(fā)原子得到大分子結(jié)構(gòu)。當(dāng)原子恢復(fù)后，其內(nèi)部磁場(chǎng)的變化可以被檢測(cè)到，從而反映出分子的原子結(jié)構(gòu)。然而，核磁共振光譜只適用于相對(duì)較小的大分子或復(fù)合體。

 

結(jié)構(gòu)生物學(xué)家也使用混合方法解析超大復(fù)合體——這是過去無法完成的任務(wù)。Kornberg*新的成果進(jìn)一步拓展了其對(duì)RNA聚合酶II的研究，并使用混合方法描述了一個(gè)由50多個(gè)蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子組成的巨大復(fù)合體。“通過多個(gè)方法的結(jié)合，他們**看到了整個(gè)復(fù)合體。每個(gè)方法的貢獻(xiàn)同樣大?！彼f。

 

仍有缺點(diǎn)

 

雖然不同的方法能帶來更多信息，但混合也會(huì)造成錯(cuò)誤的疊加。因此，混合方法的一個(gè)潛在問題是，多個(gè)錯(cuò)誤來源造成的誤差增加。Meiler指出：“我關(guān)注的是如何在整合方法的同時(shí)，減小誤差，保證得到的模型具有準(zhǔn)確性、精度和可靠性?！?

 

另一個(gè)障礙是多類數(shù)據(jù)集的共享和利用。任何一個(gè)技術(shù)都能得到豐富的信息，因此信息共享是個(gè)挑戰(zhàn)。冷凍電鏡生產(chǎn)商FEI公司的**科學(xué)家Jeffrey Lengyel表示，“每天都能生成百萬兆字節(jié)的數(shù)據(jù)”。他希望，結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域可以向高通量的遺傳生物學(xué)領(lǐng)域?qū)W習(xí)處理數(shù)據(jù)超載的方法。雖然有能靈活結(jié)合高分辨率晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)和冷凍電鏡圖的軟件，但其他方法得到的數(shù)據(jù)無法簡(jiǎn)單地混合。例如，電子順磁共振光譜測(cè)量高分子的距離和方向，而冷凍電鏡產(chǎn)生密度圖。雖然這兩種數(shù)據(jù)結(jié)合在一起非常有用，但這兩種數(shù)據(jù)語言并不相同。Meiler提出疑問，“我如何整合這些數(shù)據(jù)，如何分享?”

 

為了探討數(shù)據(jù)組織、共享和使用的*佳方式，幾十名結(jié)構(gòu)生物學(xué)家于2014年10月齊聚英國(guó)歐洲生物信息研究所。Schroder表示，目前，PDB存儲(chǔ)單個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)，應(yīng)該增加蛋白質(zhì)所有方面的數(shù)據(jù)。細(xì)節(jié)越豐富，越有助于**解析蛋白和大分子功能。

 

學(xué)界已經(jīng)做出了一些努力：目前已建立二維電子顯微鏡圖像檔案庫(kù)和三維的EMDataBank。這些檔案庫(kù)由EMBL等機(jī)構(gòu)提供資金，其中包含的數(shù)據(jù)可以共享、歸檔和分發(fā)。

 

另一個(gè)可能阻礙該領(lǐng)域的威脅是專業(yè)知識(shí)。Meiler指出，“技術(shù)需要投資，但在培訓(xùn)科學(xué)家上進(jìn)行投入也非常重要?！彼ㄗh，結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域的學(xué)生都去學(xué)習(xí)每一種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，并至少精通一種方法?！拔覀冃枰囵B(yǎng)新一代科學(xué)家理解如何整合這些不同的技術(shù)。”

 

*后，結(jié)構(gòu)生物學(xué)家必須學(xué)會(huì)提問題，提出新的、復(fù)雜的、以前被認(rèn)為不可能的生物問題。Ellenberg還表示，多虧混合方法，“很多5年前我甚至以為直到退休都沒法探索的問題能解決了”。