質粒的提取和純化實驗

1、該實驗成功的標志是把染色體DNA、蛋白質與RNA去除干凈,獲得一定得率的質粒DNA.去掉染色體DNA*為重要,也較困難,因為在全部提取過程中,只有一次機會去除染色體DNA,其關鍵步驟是加入溶液Ⅱ與溶液Ⅲ時,控制變性與復性操作時機,既要使試劑與染色體DNA充分作用使之變性,又要使染色體DNA不斷裂解成小片段,從而能與質粒DNA相分離.這就要求試劑與溶菌液充分搖勻,搖動時用力適當,一般來說當溶液Ⅰ加入時可用力振蕩幾次,因為此時**還沒有與堿和SDS作用,染色體DNA尚未釋放,不必擔心其分子斷裂,加入SDS后,則要注意不能過分用力振蕩,溫和混勻,但又必須讓它反應充分.加入溶液II混勻之后,一定在冰上放置,不要搖動,對于溶液溶液III,同樣處理! 
    2、加入溶液I之前,注意將離心管倒扣過來,將培養(yǎng)基完全流出.
    3、加乙醇沉淀DNA時,要把離心管加蓋倒翻搖動4～5次,注意觀察水相與乙醇之間沒有分層現象之后,才可以放在冰箱中去沉淀DNA,以獲得更多的DNA.
    4、乙醇沉淀DNA離心后,要把離心管四周的上清液抽干或自然揮發(fā)(可將離心管倒置于濾紙上以盡量讓管內液體流出).否則,用TE緩沖液溶解DNA時,既困難又不完全.
    5、為了得到純凈的DNA樣品和清晰的電泳條帶,加入1μl RNA酶,將管置50℃水浴箱內30min,消化RNA.
    6、抽提產物經電泳分離、EB染色后,在紫外線燈下可觀察到三個條帶,自前往后分別為：超螺旋、線性及開環(huán)質粒DNA.