磷酸鈣法轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法

一.試劑配制

無菌水ddw： 高溫**; 分裝;

2XHBS： 280mM NaCl

10mM KCl

1.5 mM Na2HPO4

12 mM glucose

50 mM HEPES

Adjust the pH , every 0.05pH from 7.00 to 7.45 using 10N NaOH, then add ddw. to the final volume. 過濾**，分裝;

2M CaCl2： 過濾**，分裝。

二. 實(shí)驗(yàn)過程：

1. 鋪細(xì)胞： 選擇狀態(tài)良好的293t細(xì)胞傳代， 2-3x105個(gè)細(xì)胞/35mm dish。

2. 20-24h后，待細(xì)胞長(zhǎng)至鋪滿瓶底約50-70%的時(shí)候，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。下面就35mm dish為例，采用以下轉(zhuǎn)染體系：

ddw： 105ul

plasmid： 2 ug (如0.5ug/ul， 即用4ul)

2M CaCl2： 16.5ul

2XHBS： 125ul

按上述順序，往eppendorf管中依次加入上述四種試劑。

先將前三者混勻， *后加2XHBS。

一種方法是，加2XHBS時(shí)要逐滴加入， 吹打至微現(xiàn)乳白色， 立即均勻滴入培養(yǎng)皿，輕輕搖勻后置于培養(yǎng)箱中，6-8h后換液。

另一種方法是， 加入2XHBS后立即吹打約40下(不過這個(gè)要根據(jù)每個(gè)人的力道和吹打的頻率而定， 建議做一個(gè)梯度實(shí)驗(yàn)，吹打不同的次數(shù)看哪次的轉(zhuǎn)染效率高以后就按這個(gè)次數(shù)來吹打)， 之后步驟同上， 立即均勻滴入培養(yǎng)皿，輕輕搖勻后置于培養(yǎng)箱中，6-8h后換液。